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　　1.什么是細胞全能性?

　　細胞全能性（celltotipotency）比較權(quán)威的定義是1984國際組織培養(yǎng)協(xié)會做出的：“細胞全能性為細胞的某種特征，有這種能力的細胞保留形成有機體所有細胞類型的能力”。這個定義比一般所說的概念“一個細胞中包含著這種生物的全部遺傳信息（基因），在適當(dāng)?shù)臈l件下可以發(fā)育成一個完整的生物體”更基本和全面。它不但包含了培養(yǎng)細胞再生成植株的情況（分化成各種類型的細胞，并以一定形式構(gòu)建成植物），同時也包含了培養(yǎng)細胞生產(chǎn)次生代謝物的情況（不分化或只分化成某種類型細胞，但仍留著分化為其他細胞類型的能力）。前者成為組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植物需要進行植株再生的理論基礎(chǔ)，后者成為像微生物發(fā)酵一樣培養(yǎng)細胞，生產(chǎn)人們所需要的次生代謝產(chǎn)物的理論基礎(chǔ)，如通過紅豆杉的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。

　　2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)是如何發(fā)展起來的？

　　技術(shù)和理論是一對孿生兄弟，相輔相成，技術(shù)手段的發(fā)明會促進理論的創(chuàng)新，理論的創(chuàng)新又會指導(dǎo)技術(shù)的實踐活動。植物組織培養(yǎng)也是如此。

　　早在1902，哈伯蘭特（Haberlandt）提出高等植物的器官和組織可以不斷地分割，直至單個細胞的觀點，預(yù)言植物體細胞在適宜的條件下，有發(fā)育成完整植株的潛力，提出了植物細胞全能性的設(shè)想，并且用植物細胞組織進行了培養(yǎng)實驗。他雖然未能獲得再生植株，卻是植物組織培養(yǎng)的開創(chuàng)者。1902他發(fā)表了著名論文《植物細胞離體培養(yǎng)實驗》，論文中提出的植物細胞全能性的理論是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。

　　從哈伯蘭特提出植物細胞全能性的理論，到1958斯圖爾德（F.C.Steward）等人第一次用胡蘿卜根的韌皮部細胞證實了植物細胞的全能性，用了整整56。56中許多科學(xué)家做的事情歸納起來都是在探索哈伯蘭特提出的“植物細胞在適宜條件下，有發(fā)育成完整植株的潛力”中的適宜條件。

　　20世紀(jì)60代以后，植物組織培養(yǎng)進入了迅速發(fā)展階段，并逐步走向生產(chǎn)應(yīng)用，如快繁脫毒、單倍體育種、種質(zhì)資源保存、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物等，也為人工種子、細胞融合、轉(zhuǎn)基因植物等奠定了基礎(chǔ)。

　　3.怎樣制備胡蘿卜培養(yǎng)基（供參考）？

　　（1）誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織

　　在MS培養(yǎng)基［注］中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的6BA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的NAA

　�。�2）誘導(dǎo)胡蘿卜叢芽

　　在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mg/L的KT和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2mg/L的NAA

　�。�3）誘導(dǎo)胡蘿卜生根

　　在1/2MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1mg/L的NAA

　�。圩ⅲ荩篗S培養(yǎng)基的配制方法見《選修1附錄3中八》。

　　4.植物組織培養(yǎng)中的愈傷組織是如何形成及再分化的？

　　植物組織培養(yǎng)中使用的外植體一般是高度分化了的細胞，在植物體中是不會再分裂繁殖的，只是執(zhí)行某種功能直至死亡。這些細胞在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時會由原來的分化狀態(tài)，變成分生狀態(tài)的細胞，分裂產(chǎn)生愈傷組織，這個過程稱為脫分化（dedifferentiation）過程。這種轉(zhuǎn)變在細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上都會產(chǎn)生一系列變化。組織培養(yǎng)的研究結(jié)果表明分化細胞的脫分化需要兩個條件，即創(chuàng)傷和外源激素。

　　目前人們對于脫分化過程的本質(zhì)還不清楚。分化細胞在細胞周期中是處于一種相對靜止?fàn)顟B(tài)的細胞（G0期細胞），脫分化是要打破這種狀態(tài)，使細胞進入細胞周期中的G1期，并沿著G1期→S期→G2期→M期的循環(huán)進行細胞分裂，形成愈傷組織�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細胞周期受基因調(diào)控，一種稱為編碼細胞周期依賴性激酶CDK（cycilindependentkinase）的基因和一種細胞周期蛋白（cyclin）可能與植物細胞脫分化的第一次分裂啟動有關(guān)。那么，什么因素誘導(dǎo)細胞周期調(diào)控基因的作用，培養(yǎng)實踐證明與外源激素有關(guān)。至于激素如何誘導(dǎo)以及誘導(dǎo)作用的過程目前仍不清楚，有待深入研究。分化細胞脫分化后細胞結(jié)構(gòu)有兩點明顯的變化：一是在細胞內(nèi)出現(xiàn)液泡蛋白；二是葉綠體轉(zhuǎn)變成原質(zhì)體。

　　當(dāng)細胞脫分化形成愈傷細胞后，經(jīng)過一段時期的分裂，細胞群體變成不是一種細胞類型的均一群，又會產(chǎn)生分化，形成分生細胞或分生細胞團，由此再生成植株有兩條途徑：一是形成體細胞胚（功能類似于受精過程產(chǎn)生的胚），通過體細胞胚形成再生植株。二是走器官發(fā)生的途徑再生植株，分生細胞在一定的誘導(dǎo)條件下重建芽的分生組織，分化出芽后再生根，成為完整的植株。

　　5.為什么要在避光條件下培養(yǎng)愈傷組織？

　　對于植物組織培養(yǎng)來說，光照條件非常重要，包括光照強度、時間和波長。但在愈傷組織的誘導(dǎo)階段往往要暗培養(yǎng)，而在分化再生的過程中一定要有光照。愈傷組織誘導(dǎo)階段的暗培養(yǎng)有利于細胞的脫分化產(chǎn)生愈傷組織，如果在光照條件下容易分化產(chǎn)生維管等組織，不利于產(chǎn)生大量的愈傷組織。

　　6.什么是人工種子？

　　人工種子（artificialseed）是指通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，外面包被著特定的物質(zhì)，在適宜的條件下可以發(fā)芽成苗的植物幼體。人工種子的概念中包含的“具有正常發(fā)育能力的材料”通常是指胚狀體（目前國外有使用不定芽、頂芽和腋芽的），它可以由三種途徑產(chǎn)生：

　�。�1）由已脫分化的外植體直接產(chǎn)生；

　�。�2）由愈傷組織產(chǎn)生；

　�。�3）由懸浮細胞培養(yǎng)產(chǎn)生。對胚狀體的基本要求是：①播種后能快速出苗；②根和芽幾乎同時生長，不產(chǎn)生愈傷組織；③同步化程度高；④活力強；⑤形成的幼苗的形態(tài)與生長要常。

　　“外面包被著特定的物質(zhì)”是指人工種皮，制作人工種皮的材料有海藻酸鈉、明膠、樹脂、瓊脂糖、淀粉等。對人工種皮的要求是：能保持胚狀體的活力，有利于貯藏運輸和萌發(fā)。選取的材料要有韌性，耐壓，對胚狀體無毒害，含有胚狀體發(fā)芽所需要的營養(yǎng)成分或植物激素，還應(yīng)含有殺菌劑，以防播種后微生物的侵害。

　　人工種子目前還存在不少問題。例如，現(xiàn)有重要經(jīng)濟價值的植物產(chǎn)生胚狀體能力弱，難以形成同步化的有強活力的胚狀體；成本較高；運輸貯藏以及機械化播種問題也未解決。因此，現(xiàn)在很少有人以生產(chǎn)為目的進行人工種子的研制。

　　7.植物微型繁殖技術(shù)高效快速的實例有哪些？

　　植物脫毒（virusfree）和離體快繁（invitropropagation）是目前植物組織培養(yǎng)應(yīng)用最多、最有效的方面。生產(chǎn)上許多無性繁殖作物均受到病毒的侵染，從而導(dǎo)致品種的嚴(yán)重退化、減產(chǎn)和降低品質(zhì)。利用植物分生組織進行培養(yǎng)可以使新長成的植株脫去病毒。利用這種方法生產(chǎn)無病毒苗的農(nóng)作物有馬鈴薯、甘薯、大蒜、草莓、蘋果、香蕉等，并已大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。離體快繁技術(shù)可以使一些植物的擴增速度比常規(guī)方法快數(shù)萬倍乃至百萬倍，而且產(chǎn)生的幼苗遺傳背景均一，重復(fù)性好，不受季節(jié)和地區(qū)限制。目前世界上已建成很多產(chǎn)百萬苗木的組培工廠，成為一種新興產(chǎn)業(yè)。離體快繁技術(shù)在觀賞植物、園藝植物、經(jīng)濟林木和無性繁殖作物上已得到廣泛應(yīng)用。

　　8.植物體細胞雜交的過程是怎樣的？

　　體細胞雜交是克服植物有性雜交不親和性、打破物種之間的生殖隔離、擴大遺傳重組范圍的一種手段。操作過程包括：原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、雜種細胞篩選、雜種細胞培養(yǎng)、雜種植株再生以及雜種植株鑒定等步驟。

　　原生質(zhì)體制備是用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶將植物細胞壁分解掉，只留下細胞膜（質(zhì)膜）包裹著細胞內(nèi)含物。原生質(zhì)體融合是指兩個原生質(zhì)體的質(zhì)膜重新組合排列形成一個質(zhì)膜，其中含有兩個細胞核。在細胞工程中一般是誘導(dǎo)融合，形成的融合細胞中所含有的兩個細胞核是來自不同的物種，稱之為異核體（heterokaryon）。誘導(dǎo)融合的手段有化學(xué)誘導(dǎo)和物理誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)因素的作用下形成的融合細胞進一步產(chǎn)生核融合，進行第一次有絲分裂。雜種細胞的篩選方法有：①細胞系互補的選擇方法，包括葉綠素缺失互補、營養(yǎng)缺陷互補和抗性互補等；②利用物理特異性差異的選擇方法：這是利用兩個原生質(zhì)體物理特異性差異的一種選擇，包括原生質(zhì)體的大小、顏色、浮密度等的不同來選擇；③利用生長特異性差異的選擇方法。需要注意的是上述選擇方法只適合部分雜交細胞的情況，有時無法選擇，就不加選擇地進行培養(yǎng)和再生成植株，然后對再生植株的雜種性狀進行鑒定。雜種細胞培養(yǎng)方法與原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法相似。體細胞雜種的鑒定方法有：①形態(tài)學(xué)鑒定。利用雜種植株與雙親在表現(xiàn)型上的差異進行比較分析，如葉片大小與形狀，花的形狀與顏色、葉脈、葉柄、花梗及表皮毛有無等；②細胞學(xué)鑒定。雜種植株細胞中的染色體數(shù)目是否比任何一方親本細胞中的染色體數(shù)目增多？理論上講如果染色體不丟失，雜種細胞中染色體數(shù)目應(yīng)為雙親染色體數(shù)目之和。也可以用基因組原位雜交的分子細胞學(xué)方法進行鑒定；③同功酶鑒定。同功酶是功能相同的酶的多重分子形態(tài)，它們是特異基因的產(chǎn)物。雜種細胞中的同功酶譜一般是雙親酶譜之和，但有時也會出現(xiàn)雙親沒有的新帶；④分子生物學(xué)鑒定。常用的方法有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性（RAPD）和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）等。

　　值得注意的是體細胞雜交尚存在一些問題：①親緣關(guān)系越遠，染色體排斥丟失的現(xiàn)象就越嚴(yán)重；②由于是兩個物種的全部遺傳物質(zhì)的合并，各種基因都在其中，選擇符合需要的個體難度大；③有時缺乏選擇雜種細胞的有效方法。因此目前整體對稱融合的工作比較少，而是采用非對稱融合，即一方親本包括了全部遺傳物質(zhì)，另一方親本只取一部分遺傳物質(zhì)，如用不具有核的原生質(zhì)體與之進行融合。

　　9.物理和化學(xué)方法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的基本原理是什么？

　　化學(xué)融合的機制：常用化學(xué)融合方法有高pH—高Ca2+法和聚乙二醇（PEG）法。高pH—高Ca2+法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的基本原理是中和原生質(zhì)體表面所帶的電荷，使原生質(zhì)體的質(zhì)膜緊密接觸，從而有利于質(zhì)膜的接觸融合。PEG處理原生質(zhì)體可以使原生質(zhì)體聚集促進融合，但PEG誘導(dǎo)融合的真正機制目前并不清楚。

　　物理融合的機制：常用方法為電融合法。此法是先將兩種原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)谋壤�混合成懸浮液，將其滴入電融合小室中，給小室兩極以交變電流，使原生質(zhì)體沿電場方向排列成串珠狀，接著給以瞬間高強度的電脈沖，使原生質(zhì)體膜產(chǎn)生局部破損而導(dǎo)致融合。

　　10.工廠化生產(chǎn)人參皂甙的基本過程是什么？

　　第一步，選擇人參根作為外植體進行培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)過培養(yǎng)選擇找到增殖速度快而且細胞內(nèi)人參皂甙含量高的細胞株作為種質(zhì)，其中一部分作為保存用，以備下一次生產(chǎn)用，一部分進行發(fā)酵生產(chǎn)。

　　第二步，將第一步選擇到的細胞株在發(fā)酵罐中的適合培養(yǎng)液中進行液體培養(yǎng)，增加細胞數(shù)量。

　　第三步，將發(fā)酵罐中培養(yǎng)的細胞進行破碎，從中提取人參皂甙。