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基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的獲取
（1）目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
（2）獲取方法：①?gòu)幕�因文�?kù)中獲��；②人工合成（反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）；③PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建
（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
（2）組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因。如圖：

①啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。
②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。
③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。
（3）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：

3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞
（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。
（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：

生物種類	植物細(xì)胞	動(dòng)物細(xì)胞	微生物細(xì)胞
常用方法	農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法	顯微注射技術(shù)	Ca2+處理法
受體細(xì)胞	體細(xì)胞	受精卵	原核細(xì)胞
轉(zhuǎn)化過(guò)程	將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA→表達(dá)	將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物	Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子

（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。
4、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)
（1）首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。
（2）其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。
（3）最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原--抗體雜交。
（4）有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物是否出現(xiàn)抗蟲(chóng)性狀。


知識(shí)點(diǎn)撥：

1、構(gòu)建基因文庫(kù)的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。
2、PCR技術(shù)：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。PCR擴(kuò)增是獲取目的基岡的一種非常有用的方法，也是進(jìn)行分子鑒定和檢測(cè)的一種很靈敏的方法。目的：通過(guò)指數(shù)式擴(kuò)增獲取大量的目的基因。
3、基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，基因文庫(kù)中的基因保存在受體菌中。
4、在基因工程的四個(gè)操作步驟中，只有第三步將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞不需堿基互補(bǔ)配對(duì)，其余三個(gè)步驟都涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)。
5、原核生物繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，有利于目的基因的復(fù)制與表達(dá)，因此常用大腸桿菌等原核生物作為受俸細(xì)胞。
6、植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程成為完整植物體，因此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞；動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。
7、轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中，從而使受體生物獲得了新的遺傳特性的現(xiàn)象，從其變化的實(shí)質(zhì)看，這種變異屬于可遺傳變異中的基因重組。

知識(shí)拓展：

1、基因文庫(kù)的構(gòu)建：
（1）概念
①基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因組文庫(kù)。
②cDNA文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因。
（2）構(gòu)建過(guò)程

基因組文庫(kù)的構(gòu)建	cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

2、人工合成目的基因
（1）反轉(zhuǎn)錄法：

（2）人工合成目的基因

3、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
①原理：DNA雙鏈復(fù)制
②過(guò)程：
第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；
第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；
第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。


相關(guān)高中生物知識(shí)點(diǎn)：現(xiàn)代生物技術(shù)在育種上的應(yīng)用

現(xiàn)代生物技術(shù)在育種上的應(yīng)用：

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種：是指按照人們的意愿，把一種生物的某個(gè)基因克隆出來(lái)，加以修飾和改造，再轉(zhuǎn)移到另一種生物的細(xì)胞里，從而定向地改造生物的遺傳性狀。包括目的基因的制備和目的基因?qū)�入受體細(xì)胞的過(guò)程。
2、轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)例：轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄、轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物（抗蟲(chóng)棉、抗蟲(chóng)玉米、抗蟲(chóng)楊樹(shù)和抗蟲(chóng)甘藍(lán)）、抗除草劑作物。
3、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)例：超級(jí)小鼠、綿羊、兔等。
4、細(xì)胞雜交育種：指將同類或不同類生物體地原生質(zhì)體或體細(xì)胞，在一定的物理或化學(xué)條件下進(jìn)行融合形成雜種細(xì)胞，再創(chuàng)造條件將雜種細(xì)胞培養(yǎng)成完整的雜種生物個(gè)體。（如馬鈴薯--番茄植株和白菜——甘藍(lán)）



相關(guān)高中生物知識(shí)點(diǎn)：DNA重組技術(shù)的基本工具

DNA重組技術(shù)的基本工具：

1、基因工程的概念：

基因工程的別名	基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)
操作環(huán)境	生物體外
操作對(duì)象	基因
操作水平	DNA分子水平
基本過(guò)程	剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)
結(jié)果	人類需要的基因產(chǎn)物

2、基本工具：
（1）“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）
①來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。
②功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專一性。
③結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。
即當(dāng)限制性內(nèi)切酶作用于特定的DNA時(shí)，把這段序列沿著特定的切點(diǎn)切開(kāi)的這個(gè)過(guò)程分兩種情況：
a、沿著中軸線切口（即沿著DNA雙鏈中對(duì)應(yīng)的磷酸二酯鍵）切開(kāi)，得到的就是兩個(gè)平末端；
b、在中軸線的兩端切口切開(kāi)，得到的就是兩個(gè)黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶就可以識(shí)別G/AATTC的DNA序列，然后在G和A間切開(kāi)，得到的就是兩個(gè)黏性末端（之間可以根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則重組）限制酶的切口不都是一長(zhǎng)一短的，一長(zhǎng)一短的叫黏性末端，一樣長(zhǎng)的叫平末端�！罢承阅┒恕痹诟咧薪滩闹幸沧鳌梆ば阅┒恕�。如圖：


（2）“分子縫合針”——DNA連接酶

種類	E·coli-DNA連接酶	T4-DNA連接酶
來(lái)源	大腸桿菌	T4噬菌體
功能特性	只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)	縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低
相同點(diǎn)	都縫合磷酸二酯鍵，如圖：

（3）“分子運(yùn)輸車”——載體
①載體具備的條件：能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存；具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入；具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。
②最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。
③其它載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒

知識(shí)點(diǎn)撥：

1、限制酶識(shí)別的序列的特點(diǎn)：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱；以為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱。

2、獲取目的基因和切割載體時(shí)使用同種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。
3、獲取一個(gè)目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生 4個(gè)黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位點(diǎn)的選擇必須保證標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測(cè)。

本文來(lái)自：逍遙右腦記憶 http://www.douzifanli.com/gaozhong/285802.html

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